背景

激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope）是20世纪80年代中期发展起来并得到广泛应用的新技术，它是激光、电子摄像和计算机图像处理等现代高科技手段渗透，并与传统的光学显微镜结合产生的先进的细胞分子生物学分析仪器，在生物及医学等领域的应用越来越广泛，已经成为生物医学实验研究的必备工具。

传统荧光显微镜使用荧光物质标志细胞中的特定结构，不仅图像与背景的对比度增强，而且由于许多荧光显微镜的光源使用短波长的紫外光，大大提高了分辨率(δ=0.61·λ/NA，其中δ为显微镜的分辨率；λ为照明光线的波长；NA 为物镜的数值孔径)。但当所观察的荧光标本稍厚时，传统荧光显微镜一个难以克服的缺点就显现出来：焦平面以外的荧光结构模糊、发虚。原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构(如耳蜗基底膜。其实是外毛细胞 、多种支持细胞 、神经纤维等组成的空间结构),，在普通光学显微镜下聚焦平面的变化， 会表现出不同的形态。假若荧光标记的结构在不同层次上都有分布，且重叠在一起，反射荧光显微镜(epifluorescent microscope)不仅从焦平面上收集光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜所接收，荧光显微镜的光学分辨率就要大大降低 。

在传统光学显微镜基础上，激光扫描共聚焦显微镜用激光作为光源，采用共轭聚焦原理和装置，并利用计算机对所观察的对象进行数字图像处理观察、分析和输出。 其特点是可以对样品进行断层扫描和成像，进行无损伤观察和分析细胞的三维空间结构[3]。 同时，利用免疫荧光标记和离子荧光标记探针，该技术不仅可观察固定的细胞、组织切片,还可以对活细胞的结构、分子、离子及生命活动进行实时动态观察和检测，在亚细胞水平上观察诸如 Ca2+，pH 值，膜电位等生理信号及细胞形态的变化，成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具，极大地丰富了人们对细胞生命现象的认识。

激光共聚焦显微镜结构

激光共聚焦扫描显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

在结构1配置上，激光扫描共聚焦显微镜除了包括普通光学显微镜的基本构造外，还包括激光光源、扫描装置、检测器、计算机系统 (包括数据采集、处理、转换、应用软件)、图像输出设备、光学装置和共聚焦系统等部分 [2]。由于该仪器具有高分辨率、高灵敏度、“光学切片”（Optical sectioning）、三维重建、动态分析等优点，因而为基础医学与临床医学的研究提供了有效手段。此外，CLSM 对荧光样品的观察具有明显的优势，只要能用荧光探针进行标记的样品就可用其观察。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量, 配合焦点稳定系统可以实现长时间活细胞动态观察。

激光共聚焦显微镜原理

在普通宽视野光学显微镜中，整个标本全部都被水银弧光灯或氙灯的光线照明，图像可以用肉眼直接观察。 同时，来自焦点以外的其他区域的荧光对结构的干扰较大，尤其是标本的厚度在 2um 以上时，其影响更为明显。

图2 激光扫描共聚焦显微镜光路图

激光共聚焦显微镜脱离了传统光学显微镜的场光源和局部平面成像模式，采用激光束作光源，激光束经照明针孔，经由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本焦平面上每一点进行扫描。 组织样品中如果有可被激发的荧光物质，受到激发后发出的荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔时先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管（PMT）探测收集，并将信号输送到计算机，处理后在计算机显示器上显示图像2。 在这个光路中，只有在焦平面的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，反差增加，成像清晰。由于照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔与探测针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦[7]。 以激光作光源并对样品进行扫描，在此过程中两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜。

应用

应用功能

激光扫描共聚焦显微镜（Confocal laser scanning microscope，CLSM)是近代最先进的细胞生物医学分析仪器之一。它是在荧光显微镜成像的基础上加装激光扫描装置，使用紫外光或可见光激光荧光探针，利用计算机进行图像处理，不仅可观察固定的细胞、组织切片，还可对活细胞的结构、分子、离子进行实时动态地观察和检测。激光扫描共聚焦显微技术已用于细胞形态定位、立体结构重组、动态变化过程等研究，并提供定量荧光测定、定量图像分析等实用研究手段，结合其他相关生物技术，在形态学、生理学、免疫学、遗传学等分子细胞生物学领域3得到广泛应用。

组织和细胞中的定量荧光测定

激光扫描共聚焦显微镜可以从固定和荧光染色的标本以单波长、双波长或多波长模式，对单标记或多标记的细胞及组织标本的共聚焦荧光进行数据采集和定量分析,同时还可以利用沿纵轴上移动标本进行多个光学切片的叠加， 形成组织或细胞中荧光标记结构的总体图像,以显示荧光在形态结构上的精确定位。 常用于原位分子杂交、肿瘤细胞凋亡观察、单个活细胞水平的 DNA 损伤及修复等定量分析。

细胞间通讯的研究