介绍

DNA测序技术，又叫基因测序技术。

人类基因组这部由A、T、G、C四个字母组成的卷帙浩繁的生命天书如同一座宝库，保藏着几千年来人们迫切想知道的秘密，DNA测序技术就好似“芝麻开门”这样的咒语，是我们打开宝库的金钥匙。世界上第一个测定DNA序列的方法是由英国生化学家弗雷德里克·桑格尔发明的。自此DNA测序的速度就一直呈加速态势。2001年人类基因组草图耗资4.37亿美元，耗时13年。到了2007年，第一个完整人类基因组序列图谱的诞生只花费了150万美元，3个月就搞定。2009年1月2日，美国加州太平洋生物科学公司的科学家乔纳斯·考尔拉赫、斯蒂芬·特纳及其研究小组在《科学》杂志上发表论文称，他们将纳米技术与芯片技术相结合，发明了一种新型测序方法，速度是现有技术的3万倍。

DNA sequencing technology

Sanger 法测序的原理就是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X- 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。

非同位素银染测序系统操作技术

DNA测序策略

Promega公司的SILVER SEQUENCETM DNA测序系统是一种无放射性的序列分析系统，它通过灵敏的银染方法检测凝胶中的条带。银染提供了一种对于放射性或荧光法来说更加快速，廉价的替代方法。测序结果可以在同一天内得到；电泳完成后经90分钟就可读序，这是常规的放射性测序法做不到的。 此外, SILVER SEQUENCETM系统用未修饰的5'OH寡聚核苷酸作为引物，减少了特殊修饰寡聚核苷酸的花费。该系统不需要放射性方法中对同位素的谨慎操作，也不需要荧光法或化学发光技术的昂贵试剂。另外，也不需要象大多数荧光法那样用仪器来检测序列条带。Taq DNA聚合酶在95℃时极强的热稳定性。本系统利用的测序级Taq DNA聚合酶是一种Taq DNA聚合酶的修饰产品，对于双链DNA模板有非常好的效果，具有高度的准确性，能产生均一的条带，且背景低。

SILVER SEQUENCETM系统包含被修饰的核苷酸混合物，如7-去氮dGTP(7-deaza dGTP，或dITP)替代dGTP可清除由GC丰富区域所引起的条带压缩现象。

退火温度是热循环测序中最重要的因素。高退火温度可减少模板二级结构。提高引物结合模板配对的严谨性。链重退火和模板二级结构则限制了小片断PCR产物(<500bp)得到清楚的序列数据的能力。引物延伸起始于每个循环的退火阶段。在较低温度时，聚合酶可能会遇到坚固的二级结构区域，它可导致聚合酶解离。则在四个电泳道中均有同一相对位置的条带。因为这些原因，应该使用尽可能高的退火温度。对于有牢固二级结构的模板建议使用95℃变性、70℃退火/延伸的循环模式。一般来说，较长的引物及GC含量高的引物能得到较强的信号。实验结果表明，>24mer的GC含量约为50%的引物可得到最佳结果。

由于本系统采用热循环装置, 与常规的测序方法相比具有如下几点好处：(1).本方法线性扩增模板DNA产生足够的产物使银染技术能够检测序列条带，测序反应需要0.03-- 2pmol模板DNA, 随模板种类而定。(2). 在每一个变性循环中的高温可以取代对双链DNA(dsDNA)模板的碱变性及乙醇沉淀过程，变性循环也有助于消除由于线性dsDNA模板(如PCR反应产物)快速重退火所引起的问题。(3). 高温聚合酶反应减弱了DNA模板的二级结构，允许聚合酶穿过高度二级结构化的区域。

材料

待测已提纯的DNA，可为单链，也可为双链。

科学家在一个蚀刻有纳米结构的微阵列芯片上放置了数以千计的波导管。这是一种微型、中空的金属管，直径大约20纳米，体积大约是1毫微微微升，一个DNA分子外加一个DNA多聚酶分子便可将管内空间占满。这样一来，仅在一块小小的芯片上，就能同时进行数千个测序反应。尤其可贵的是，在这种微型波导管中进行测序反应时，干扰会显著减少，也就是说可以大幅提高精确度。

目前的产品中，每个芯片上的波导管大约有3000个，太平洋生物科学公司打算2010年推出这一级别的产品。据公司创始人特纳预计，到2013年，将实现每张芯片放置一百万个波导管，届时将能在半小时内测完人类基因组全序列，精确度达到99.999%，花费低于1000美元。

尽管美国得克萨斯州贝勒医学院的迈克尔·梅兹克博士表示特纳的展望过于乐观，但这样惊人的速度让我们仿佛看到了计算机CPU曾经的前进步伐——集成电路上容纳的晶体管数目，每18个月就会增加一倍，性能也将提升一倍。有人评论道，DNA测序技术将跟随计算机技术和通讯技术成为第三个“摩尔定律化”的学科产业。

设备

DNA测序仪，性能特点，自动化程度高，提供连续、无需监控的操作，自动灌胶、上样、电泳分离、检测及数据分析，可连续运行24小时无需人工干预。样品分析量大，一束毛细管可同时对16个样品进行全自动分析，一天可完成数百个样品的测序或片段分析工作。先进的荧光检测系统，采用光栅分光，CCD摄像机成像技术，实现多色荧光同时检测，与传统的滤镜及光电倍增管的检测方式相比，光栅及CCD的优势在于更新荧光化学时无需更换任何硬件设备。从激光光源发出的光线被光学元件分成两股，16根毛细管被一束激光同时从两面照射，有效提高荧光检测灵敏度和均一性。DNA测序仪在2011年前多由美国生产。

2011年4月18日，由中科院北京基因组研究所与中科院半导体研究所承担的“模块化DNA分析系统”项目通过评审验收。这标志着我国在第二代DNA测序仪研发方面，形成了具有自主知识产权的高通量DNA测序技术及其系统样机。日前，验收组对该项目进行了测试和验收考核。验收组认为，此项目完成了仪器研制项目实施方案所要求的各项技术指标，有效测序片段数量、平均读长和有效序列数据总产量等关键技术性能指标远远优于立项指标，该成果实现了与国际主流设备性能相当的国产化DNA测序能力，在基因组学、生物信息学，乃至生命科学诸多方向的基础研究和应用研究方面具有重要实用价值。项目负责人、中科院北京基因组所副所长于军表示，计划下一步将继续开发适应于我国科研需求的下一代测序仪、配套试剂、芯片和测序分析软件等，使这一设备全面实现系统功能。