杂交技术

简介

荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世纪80年代末在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记而形成的一种新的原位杂交方法,探针首先与某种介导分子(reporter molecule)结合,杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧光染料.FISH的基本原理是将DNA(或RNA)探针用特殊的核苷酸分子标记,然后将探针直接杂交到染色体或DNA纤维切片上,再用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与探针分子特异性结合来检测DNA序列在染色体或DNA纤维切片上的定性、定位、相对定量分析.FISH具有安全、快速、灵敏度高、探针能长期保存、能同时显示多种颜色等优点,不但能显示中期分裂相,还能显示于间期核.同时在荧光原位杂交基础上又发展了多彩色荧光原位杂交技术和染色质纤维荧光原位杂交技术.。

背景

对于利用rRNA的荧光原位杂交来说，如下原因可导致较低的荧光信号强度：

较低的细胞核糖体含量

较低的细胞周边的通透性

较低的目标序列可接触性（由于rRNA的折叠产生的构象，有些位置与rRNA分子内其他链或其他rRNA或蛋白紧密接触，从而使探针无法和目标序列杂交）

为检验细胞中的目标序列是否容易被探针杂交，及测试最佳杂交温度，可利用“克隆荧光原位杂交”(clone-FISH)进行试验：将rRNA基因结合入质粒，转化至大肠杆菌中表达，构成核糖体，再用荧光标记的探针杂交。

FISH可与流式细胞术联用，对特定荧光标记的细胞进行计数或者分离。

变体

酶联荧光原位杂交(CARD-FISH)

发展历程

位点数目及检测目标

在FISH 技术基本确立之后，FISH 不仅用于单基因或核酸检测，FISH 技术的进一步发展扩展到多色FISH 多基因位点同时检测，从基因检测发展到基因组、染色体、活细胞中转录产物mRNAs 原位检测以及组织水平的核酸检测，并且在今后的研究中还有可能应用到整个生物体的检测。早期的探针较大，是通过载体的增殖、缺口平移法、体外转录法和随机引物DNA 合成法来制备以获得特异性杂交克隆。然而大片断的探针通常带有重复序列造成高荧光背景，采用未标记的核酸进行预处理使其与非特异性位点结合用于抑制非特异性杂交可以克服上述问题，同时也使得研究者扩大了检测目标，实现了整条染色体染色。在细胞遗传学上FISH 技术在染色体分析方面也因此得到了显著的提高。如通过比较基因组杂交（Comparativegenomic hybridization）用于检测染色体区域的缺失和重复。大片段探针一旦和样品非特异性结合就会形成一个信号，混淆染色体上基因的检测，就需要剪切成小片段<200核苷酸。现在检测手段的提高以及检测软件的不断发展使得FISH技术的检测要求越来越低，灵敏度越来越高。精确的计算机图片处理算法的不断改进形成了亚显微水平的探针高分辨技术。随着检测目标越来越小，FISH技术已用于隐蔽的亚端粒核型基因重排和精确的染色体作图及单拷贝mRNA的检测。

FISH 检测范围的扩大，使得FISH 技术的应用在20 世纪90 年代急速增长。由FISH 技术应用而形成的分支技术实现了越来越多的不同类型位点同时检测。首先是采用不同的荧光素来检测多位点，如双色荧光用于检测特异的核酸序列，每一条染色体、基因或者转录产物分别由一种可以分辨的荧光信号来表示。之后是采用两种色彩译码方案进一步扩大了FISH 应用范围。译码方案主要是针对色彩比例，即每一种颜色在总颜色中所占的比例来描绘多位点。前述的每一种方法，或是两种方法的结合都已经将可检测位点多达12 个。采用计算机翻译的五色方案可同时检测出人类所有染色体代表着FISH 技术多位点检测的里程碑。尽管可以采用多种方法观测到mRNAs，但是FISH 对整个转录产物的原位分析似乎更有应用前景。色彩译码技术已经实现了对整个组织的检测。

定量分析阶段

Pinkel 等（1986）首次将荧光图像定量分析用于基本细胞遗传检测，采用双色激发块装置照相机检测荧光信号，而且定量分析技术很快用于了mRNA 检测。荧光检测的关键是信号的重现性、无规律性及背景的自发荧光。不仅不同的样品之间荧光不同，而且同一载玻片上的材料或者同样的细胞都有可能显示出不均衡的荧光。目前已有多种方法用于消除一些组织中的自发荧光：如样品制备过程中，采用的消除自发荧光试剂包括硼氢化钠或者采用光照辐射进行预处理以消除非特异性背景信号。这些消除自发荧光的方法并不完全有效，通常在进行图像分析时通过计算机算术除去自发荧光信号。荧光图像的光谱数据包括真正的信号和许多杂噪，分别进行分析并且通过单独的光谱组分分析除掉杂噪数据。多色FISH 有自身的限制，包括不同的荧光强度和颜色重叠。但是通过计算机算法分析平衡了多色图像，包括强度变化和自动纠正信号重叠。

FISH图像自身的限制并没有影响到自动破译算法的发展。采用序列较大探针进行DNA 位点检测和多色荧光计数算法辅助病理学家实现了自动化分析。此外，检测探针试剂盒和点计数方法的应用为便捷的检测结果提供了一个平台。尽管多种方法已经用于分析或优化自动细胞检测系统，人工的细胞病理检测仍是可信度高的组织分析方法。然而，细胞制备、鉴别、固定介质上细胞样品计算机化检测在未来的医学诊断中的高效益性不容忽视，快速检测细胞内的分子信号只有通过计算机辅助方法进行检测。现在，自动化检测程序已经扩展到采用多基因转录模型检测特异的DNA 簇和转录位点以确定功能细胞的状态。