伊森·温特斯/Ethan WintersCV：Todd Soley(英)、木内秀信(日)本作的可操纵角色之一，来到路易斯安那州踏上寻妻之路。沉着、冷静的男人。在接到失踪三年的妻子米娅发来的邮件后，来到贝克农场寻找米娅。在贝克家经历了一个惊心动魄的夜晚。在阴差阳错击败杰克、玛格丽特和伊芙琳成为英雄后获救。游戏几乎无法看到伊森的正面，在游戏中，伊森最常说的词是“Fuck”。

米娅·温特斯/Mia WintersCV：Katie O'Hagan(英)、樋口晓里(日)本作的可操纵角色之一，录像带“米娅”、“旧的录像带”以及游戏后半部分的主角，伊森的配偶。她是负责看管生化兵器伊芙琳的监护员，对外扮演伊芙琳的母亲。对伊森谎称自己是在做保姆的工作。在三年前油轮事件时昏厥并失忆，随后被贝克一家救出。但是已经被伊芙琳感染的她时而表现出极度的暴力倾向，因此被卢卡斯关在地下室，并于伊森找到她的时候用电锯砍掉了伊森的左手。在结局“徒留回忆”中，被伊森杀死。在结局“夜之尽头”中获救。

杰克·贝克/Jack BakerCV：Jack Brand(英)、山路和弘(日)贝克家的一家之主，神出鬼没的男人。杰克原本是一个朴实善良的农民，膝下一女一子。在三年前救出伊芙琳后被伊芙琳感染并控制。从此便丧失了人性。在伊森与米娅的战斗刚刚结束后突然出现在伊森背后并一拳将他击晕。在伊森逃跑后对伊森穷追不舍。本身因为霉菌的感染而拥有极强的自愈能力。即使被打倒也能很快恢复。在最后，变异的杰克被伊森击败，被伊森用抗菌血清杀死，但是在DLC“佐伊的结局”中再次以新怪物“沼泽泥人”的身份再次复活，最终被哥哥乔·贝克装备的AMG-78铁拳彻底杀死，其大脑被直接摧毁，然后下半身钙化。（最后结果未知，可能还会复活。）杰克在游戏中说的第一句话是"欢迎来到这个家庭，孩子。"

玛格丽特·贝克/Marguerite BakerCV：Sara Coates(英)、伊泽磨纪(日)贝克一家的女主人，杰克的妻子。和杰克一样，玛格丽特夫人原来是一个贤妻良母，在路易斯安那州过着恬静、悠闲的生活。在被伊芙琳感染之后变得凶暴、残忍起来。伊森在探索老房子时，她用提灯控制昆虫追捕逃走的米娅和伊森。最终在温室里，变异的玛格丽特也被伊森所击败，其提灯随后也被夺走。

佐伊·贝克/Zoe BakerCV：Giselle Gilbert(英)、小林优(日)杰克和玛格丽特的女儿，录像带“女儿们”的主角，给每一个被抓到贝克家的可怜鬼逃生的提示的人。在三年前杰克发现伊芙琳的那个夜晚，佐伊目睹了父亲和母亲的异变。受到惊吓的她通过米娅了解了血清的配方。佐伊平时不在房子里住，而一个人住在院子的拖车里，因而受感染程度较小，未被伊芙琳完全控制。她一边抵抗被感染的父母，一边寻找着制作血清的原料。在伊森到来以后，她通过电话指示伊森的行动，并让他寻找血清原料。在结局"徒留回忆"中全身钙化而亡。在结局"夜之尽头"中被留在了贝克家。但是在DLC“佐伊的结局”中，游戏的开场剧情固定为“夜之尽头”，佐伊在沼泽里游走三周后被因霉菌感染的扩散，全身晶体化。被两个蓝色保护伞士兵发现，随后他的伯伯——乔·贝克赶来，误以为是士兵害她变成这样的，几下打倒了两个士兵（那时乔还不知道蓝色保护伞的存在）后踏上了为佐伊寻找解药的道路。最后，乔得到了足够的解药并打倒杰克，佐伊成功得到救治。（在DLC的最后佐伊接到了伊森打来的电话，知道伊森一直没有放弃她。）

卢卡斯·贝克/Lucas BakerCV：Jesse Pimentel(英)、佐藤节次(日)杰克和玛格丽特的儿子，反社会的天才。卢卡斯是一个工程学的天才，第三方组织“The Connections”的研究员，小时候获得奖杯无数，擅长制作机关。但他有精神问题，其内心十分扭曲并且有反社会心理，喜欢折磨他人，还乐此不疲，童年时期曾经用自己设计的机关将一个叫奥利弗的恶霸关在自己房间的阁楼里并让他活活饿死直至尸体腐烂。因为伊芙琳的到来可以随意抓街上的人来折磨而感到高兴，并不想让时间倒回到伊芙琳到来之前。他实际上只保留在被感染的初期，伊芙琳无法控制他。他暗中和第三方组织“The Connections”联系，观察伊芙琳作为生化兵器的表现。在伊森到来之后想尽办法折磨伊森，囚禁了米娅和佐伊。但最终谜题都被伊森破解，卢卡斯气急败坏，留下D系列的头后逃走，躲进地下矿井研究更加强力的菌兽。在得知BSAA派遣出克里斯来缉捕自己的消息之后，卢卡斯更是为克里斯设下了重重机关，但均被克里斯破解。最后，走投无路的卢卡斯不自量力的去和克里斯搏斗，但被克里斯打倒在地，随后卢卡斯把自己变成怪物与克里斯战斗，但最终还是被克里斯所打倒。

乔·贝克（铁拳老乔）/Joe BakerCV：Gage Maverik(英)、广田行生(日)贝克家族中的最年长者，DLC“佐伊的结局”的主角，退伍军人，杰克·贝克的哥哥。乔的过去并不为人所了解，除了他曾打破自己弟弟杰克的鼻子，与弟弟一起在美军中服役。他独自在贝克家附近的沼泽地里过着与世隔绝的生活，甚至不了解贝克一家的异变与蓝色保护伞的存在。他的一生以及作为退伍军人使他智力过人、身强力壮，并拥有独特的生存技巧，知晓什么昆虫可以被直接食用。在一次偶然的遭遇中，他看到蓝色保护伞士兵与他的已经晶体化侄女——佐伊·贝克，误以为侄女的异变是士兵害的，打倒两个士兵并把其中一个带回家中拷问。得知解药的藏匿处后起身前往，但仅得到半管解药。在历经艰险得到整管解药后，一个巨型怪物出现，乔被迫与怪物战斗。他赢了，就在回到佐伊身边时，怪物又一次出现并劫走了佐伊。乔来到废弃教堂，反击时才发现这个怪物就是自己的亲生弟弟杰克，而后自己被杰克打晕并装进棺材扔到河里。然而乔大难不死，在获取了蓝色保护伞研发出的AMG-78铁拳后，在贝克家的正门与杰克展开最后的对决。最终乔杀死了杰克并成功将解药注入佐伊体内，佐伊终于得到了救治，后来乔来到了蓝色保护伞部队的营地继续照顾尚未康复的佐伊7。

艾伦·道格拉斯/Alan Bobby DouglasCV：Kip Pardue(英)、安原义人(日)遇难船安娜贝尔号的船长，扮演伊芙琳监护人。2014年护送伊芙琳通过安娜贝尔号转移到南美洲的分公司。但是当船行驶到路易斯安那州时伊芙琳突然暴走并袭击船员，艾伦也被感染，最后被伊芙琳控制杀死。

安德烈·斯蒂克兰德/Andre SticklandCV：Christopher Ashman(英)、志村知幸(日)《下水道的鳄鱼》探险节目主持人之一，龙套角色，来到阴宅贝克家录制节目。在录制过程中独自行动而被杰克抓住，用下水管刺穿其喉咙而死，其腐烂生蛆的尸体在伊森来到下水道寻找米娅的时候发现。（即玩家在下水道遇到的浮尸）

彼得·沃肯/Peter WalkenCV：Robert Vestal(英)、落合弘治(日)《下水道的鳄鱼》探险节目主持人之一，只是个代班主播。在探索贝克家的时候被杰克抓住，后在VR专属的《厨房Demo》中试图解救克兰西时被米娅斩首。（正式版中看不到）

克兰西·贾维斯/Clancy JarvisCV：Tony Vogel(英)、关雄(日)《下水道的鳄鱼》探险节目的新人摄影师。同时也是VR专属的《厨房Demo》，录像带“废弃房屋录像带”、“生日快乐”和DLC“噩梦”、“卧室”、“21点”的主角。在探索贝克家的时候被杰克抓住，后来被交给了卢卡斯。用摄影机记录下了贝克家不为人知的事实真相。他在贝克家做了挣扎和逃生的尝试，在一波波菌兽的攻击下坚持下来（“噩梦”），摆脱了玛格丽特的控制（“卧室”），在“21点”中在卢卡斯的赌场里击败了对手霍夫曼。但是在“生日快乐”录像带中被卢卡斯设计的机关烧死（但是根据录像带“生日快乐”上的时间，“生日快乐”发生在“噩梦”、“卧室”和“21点”之前，“生日快乐”发生在2017年6月2日凌晨1:11，卧室发生在2017年6月2日下午4:5x，“21点”发生在2017年6月3日下午2：x2，“噩梦”发生在2017年6月1x日晚上2x:x5，结束在凌晨5:00，这可能是官方的疏忽），后来录像带被伊森捡到，给了伊森破解谜题的重要提示8。

大卫·安德森/David AndersonCV：Hari Williams(英)、河合稔(日)来调查贝克家失踪案的副警长。龙套角色，给了伊森一把折叠刀后让伊森前往车库与其汇合。在车库与伊森对话时被杰克从背后偷袭，脑袋被铲子削去一半，其配枪格洛克17被伊森捡起。游戏中并没有直接出现副警长的名字，在最后配音表出现。

菌兽(Molded)菌兽是玩家在游戏中面对的主要敌人。是由mutamycete霉菌形成的有机意识体。约2m高，长着锋利的爪子和牙齿，全身由菌丝覆盖。它们拥有极强的自我保护意识与求生欲望，稍微受到挑衅就会强烈还击，用利爪攻击和牙齿撕咬它们的敌人。因为从菌丝中诞生，又有兽性，而把它们命名为“菌兽”。只有摧毁它们的头部或者将它们撕个稀巴烂才能将它们消灭。移动速度：☆☆ 攻击力：☆☆☆ 皮厚指数：☆☆☆菌兽会从任何有菌斑、菌落的地方诞生。

强化型菌兽(Strong Molded)普通菌兽的强化版，长着十分健壮的黑色右臂。血值和攻击力都比一般的菌兽高。（在DLC“佐伊的结局”和“不是英雄”中，出现了另外几种强化型菌兽）移动速度：☆☆ 攻击力：☆☆☆☆ 皮厚指数：☆☆☆☆

四脚菌兽(4-Legged Molded)用四只脚在地上爬行的菌兽，行动迅速，攻击力极高，但血值极少。（一般手枪爆头两枪就可杀死）它们爬行的速度比玩家奔跑的速度要快一些。它们会突然跳起扑向玩家，也能爬到墙壁上再扑过来袭击玩家，比强化型菌兽更加有威胁。移动速度：☆☆☆☆☆ 攻击力：☆☆☆☆☆ 皮厚指数：☆☆

胖菌兽(Fat Molded)强大的菌兽，体型硕大，行动缓慢，血值极高，出场次数不多。菌丝覆盖的体表下隐藏了酸性物质。能够远距离向玩家喷射酸液，受到攻击时也能从体内喷出酸液。如果玩家靠的过近向它攻击，就会被酸液伤害到。死后尸体会爆开，如果玩家靠得过近，会受到极高的伤害。（在DLC“不是英雄”中会出现小BOSS级胖菌兽，不仅会吐出酸液，还会生出小虫子）移动速度：☆ 攻击力：☆☆☆☆ 皮厚指数：☆☆☆☆☆

大型昆虫/Flying Insects (Large)一种依附在墙壁上或生成在蜂巢里的类似蜜蜂的昆虫，玩家靠近时会飞起来，并不定期用尾部的鳌刺攻击玩家。攻击力一般，但血值极少，受到玩家的攻击就会被立即粉碎。因此威胁不大。攻击力：☆☆☆ 皮厚指数：☆

蜂群/Flying Insects (Small)成群结队的小型飞行昆虫构成了一个蜂群，对靠近的玩家叮咬。对火敏感，用喷火器可以快速消灭。与6代中的蜂群不同的是，这个蜂群并没有核心，只是一堆小型昆虫组成的团体。攻击力：☆ 皮厚指数：☆蜂巢和玛格丽特都可以召唤蜂群。

蜂巢(Hive)在老房子随处可见的蜂巢状的脓包，孕育着大量小型飞行昆虫。当玩家靠近时就会产生蜂群来自卫。对火敏感，用喷火器可以将其迅速消灭。一般的蜂巢拥有两层有机物质作为防卫，消灭有机物质后才会露出核心。变异的玛格丽特钻洞逃跑后，会有一定概率生成一个小型蜂巢堵住洞口。小游戏“伊森必须死”中的蜂巢不会产生蜂群。只有堵路作用

蜘蛛(Cabinet/Door Critters)攀附在门或者壁橱柜上的敌人，不会主动攻击。当玩家靠近时会扑向玩家并对玩家造成较高伤害，用喷火器可以轻松除掉。未除掉爬虫的门或者壁橱柜无法被打开。攻击力：☆☆☆ 皮厚指数：☆用刀子清除一扇门上的所有蜘蛛可以获得“砍，砍，大力的砍！”成就