分离原理

排阻色谱法（SEC）亦称空间排阻色谱或凝胶渗透色谱法。是一种根据试样分子的尺寸进行分离的色谱技术。

排阻色谱的分离机理是立体排阻，样品组分与固定相之间不存在相互作用的现象。色谱柱的填料是凝胶，它是一种表面惰性，含有许多不同尺寸的孔穴或立体网状物质。凝胶的孔穴大小与被分离的试样大小相当。仅允许直径小于孔开度的组分分子进入，这些孔对于流动相分子来说是相当大的，以致流动相分子可以自由地扩散出人。对不同大小的组分分子，可分别渗入到凝胶孔内的不同深度，大个的组分分子可以渗入到凝胶的大孔内，但进不了小孔，甚至于完全被排斥。小个的组分分子，大孔小孔都可以渗进去，甚至进入很深，一时不易洗脱出来。因此，大的组分分子在色谱柱中停留时间较短，很快被洗出，它的洗脱体积（即保留时间）很小。小的组分分子在色谱柱中停留时间较长，洗脱体积卿保留时间）较大，直到所有孔内的最小分子到达柱出口，这种按分子大小而分离的洗脱过程才告完成。

因为分子尺寸一般随分子量的增加而增大，所以根据分子量表达分子尺寸比较方便。将因分子过大而不能部分地进入某一给走固定相孔内的最小的样品粒子的分子量，定义为该固定相的排阻极限。

可以预料，相对分子质量介于上述两个极限之间的化合物，将根据它们的分子尺寸，进入一部分孔隙，而不能进入另一部分孔隙，其结果使这些化合物按相对分子质量降低的次序被洗脱。所以，在选择固定相时，应使欲分离样品粒子的相对分子质量落在固定相的渗透极限和排阻极限之间。由色谱过程的基本方程式可得：VR=V0+KsecVi式中VR为保留体积（溶质洗脱体积），Vt为凝胶颗粒之间的体积（也称为间隙体积）；Vi为凝胶内孔体积，也即溶质分子能够渗透过去的那部分体积（也称为总孔容积）；Ksec为排阻色谱的分配系数。所以，Ksec被定义为溶质分子渗入内孔体积的分数，其数值在0～1之间，其值取决于组分分子的大小。对于完全不能进入凝胶孔内的大分子（即大于排阻极限的物质），其分配系数为零，即Ksec一Cs/Cm=O，则VR=V0；对于能自由出入凝胶孔的小分子，其在固定相内部的浓度与在固定相外部的浓度相同，则Ksec=1，即VR=V0+Vi因此所有组分只能在V0和V0+Vi的洗脱体积之间被依次洗脱下来，不会超越这个界限。同时还可以看出，柱子的间隙体积V0可通过测量相对分子质量大于固定相排阻极限的物质的保留体积而决定；对于已知V0的柱子，其固定相体积（总孔容积）可通过测量相对分子质量小于固定相渗透极限的物质的保留体积而决定。因为该物质Ksec为l，VR和V0已知，所以利用式VR=V0+KsecV可计算Vi。能够部分进入固定相孔内的物质其分配系数一定在0与1之间，可通过把物质的Vi，V0和保留体积代人式VR=V0+KsecV而求出。

排阻色谱法中，保留时间是分子尺寸的函数，因此有可能提供分子结构的某些信息。它主要用来获得分散性聚合物的相对分子质量分布情况。但它不能分辨分子大小相近的化合物。一般说来，分子量的差别需在10%以上时才能得到分离，所以该法不能用于分离复杂的混合物12。

特点

1.保留时间是分子尺寸的函数，有可能提供分子结构的某些信息。

2.保留时间短，谱峰窄，易检测，可采用灵敏度较低的检测器。

3.固定相与分子间作用力极弱，趋于零。由于 ,柱子不能很强保留分子因此柱寿命长。

4.不能分辨分子大小相近的化合物，相对分子质量差别必须大于10%能得以分离。

5.大分子的流程短，移动速度快，先流出色谱柱；小分子的流程长，移动速度慢，后流出色柱；而中等分子居两者之间。

6.生物相容性好，有很高的活性回收率。

类型

凝胶过滤色谱：用于分析多肽、蛋白质、核酸、多糖等。凝胶的代表是葡萄糖系列；流动相是水

凝胶渗透色谱法：用于分析高聚物的摩尔质量，如：聚乙烯、聚氯乙烯等。

常用的凝胶为交联聚苯乙烯凝胶；流动相是有机溶剂（四氢呋喃）

填料和流动相

排阻色谱分离的基础是不同分子大小的组分进人填料内孔深度的不同。因此，选择和搭配具有不同孔径，色谱性能良好的填料是很重要的，填料孔径大小应与试样分子量的大小相适应。