简介

基于天然蛋白质结构的蛋白质分子“小改”是指对已知结构的蛋白质进行少数几个残基的修饰、替换或删除等，这是目前蛋白质工程中最广泛使用的方法，主要可分为蛋白质修饰和基因定位突变两类。基因定位突变是指从基因水平上进行蛋白质分子的改造，即采用定位诱变的方法，对编码蛋白质的基因进行核苷酸密码子的插入、删除、置换和改组，然后对突变后的基因进行蛋白表达并分析所表达蛋白质的功能活性，其结果为蛋白质分子改造提供新的设计方案。

定位突变的设计目标及解决方法

定位突变常见的设计目标是提高蛋白质的热、酸稳定性、增加活性、降低副作用、提高专一性，以及通过蛋白质工程手段进行结构一功能关系的研究等。Hartley等于1986年完成了一个我们所要的设计目标及解决的办法，至今仍有重要的参考价值。其中蛋白质的稳定性是蛋白质正常发挥生物活性的重要前提，因此改善蛋白质的稳定性成为蛋白质设计和改造的重要目标之一。

定位突变的种类

要进行基因定位突变，改变DNA核苷酸序列，方法有很多种，如基因的化学合成、基因直接修饰法、盒式突变技术等。根据基因突变的方式，还可以分为以下三类：插入一个或多个氨基酸残基；删除一个或多个氨基酸残基；替换或取代一个或多个氨基酸残基。要达到基因定位突变的目的，多采用体外重组DNA技术或PCR方法。

定点突变

蛋白质中的氨基酸是由基因中的三联密码子决定的，只要改变其中的一个或两个碱基就可以改变氨基酸的种类，从而产生新的蛋白质。通常是改变功能区域某个位置的氨基酸，以研究蛋白质的结构、稳定性或催化特性。点突变的工作是当前蛋白质工程研究的主体，到目前为止，已经对枯草杆菌蛋白酶、T4溶菌酶、二氢叶酸还原酶、胰蛋白酶以及核糖核酸酶等许多种类的蛋白质进行改造试验。例如，将组织型纤维蛋白酶原活化剂(tissue-type plasminogen activator，t-PA)的Asn117替换为Glu117，从而除去一个原有的糖基化位点；由于该处原有的糖链能促进t-PA从血浆清除，因此点突变后能够降低t-PA的血浆清除率，延长血浆半衰期。

盒式突变

1985年Wells提出的一种基因修饰技术一盒式突变，一次可以在一个位点上产生20种不同氨基酸的突变体，可以对蛋白质分子中重要氨基酸进行“饱和性”分析。利用定位突变在拟改造的氨基酸密码两侧添加两个原载体和基因上没有的内切酶切点，用该内切酶消化基因，再用合成的发生不同变化的双链DNA片段替代被消化的部分。这样一次处理就可以得到多种突变型基因。

定位突变的程序

基因定位突变的蛋白质分子设计程序遵循设计原理中的程序，但基因定位突变又有其特殊性，其具体的程序如下。

1、建立所研究蛋白质的结构模型

建立蛋白质三维结构模型，对确立突变位点或区域以及预测突变后的蛋白质的结构与功能是至关重要的。可以通过X射线晶体学、二维核磁共振等测定结构，也可以根据类似物的结构或其他结构预测方法建立起结构模型。

2、找出对所要求的性质有重要影响的位置

在改造中如何恰当地选择突变残基是一个关键问题，这不仅需要分析残基的性质，同时还需要借助于已有的三维结构或分子模型。例如，通过引入二硫键期望提高蛋白质的稳定性，面临的一个问题是怎样选择合适的突变位点。蛋白质中的二硫键具有一定的结构特征，随机选择突变位点引入二硫键会给整个分子带来不利的张力，不但不会提高蛋白质的稳定性，反而会降低蛋白质的稳定性。选择突变残基，最重要的信息来自结构特征。因此，如果蛋白质的立体结构是未知的，则突变功能残基的研究带有不确定性，不能很好区别蛋白质构象扭曲变化的影响与原有功能残基突变的影响。①为解决这个问题，人们尝试了几何方法、分子力学方法、分子动力学等多种方法，并已经编制了一些实用的程序，可以在试验前筛选可能的以及较好的突变位点。相类似的，对于其他类型的突变也可以进行预测。目前已有许多方法和程序可以在已知天然蛋白质结构的基础上预测突变体的结构和性质，这些设计工作为人们的实验工作提供了信息和指导；②可以根据序列同源性或原先的生物化学实验证据来选择突变残基，也可以通过随机或合理筛选技术鉴定重要的功能区域，以便进一步重点分析蛋白质功能残基；③可以从天然蛋白质的三维结构出发，利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸。同一家族中的蛋白质的序列对比、分析往往是一种有效的途径。需要认真考虑此种性质受哪些因素的影响，然后逐一对各因素进行分析找出重要位点，这是分子设计的关键。

在具体选择突变残基时，一方面要满足蛋白质可能具有所要求的性质，另一方面又尽量维持原有结构，使其不做大的变动。尽量在同源结构中此位点已有的氨基酸残基表中进行选择，同时考虑残基的体积、疏水性等性质的变化所带来的影响。还应确定序列中对折叠敏感的区域，确定对功能重要的位置，考虑剩余位置对所希望改变的影响，考虑它们对结构特征的影响，以及它们对蛋白质功能的影响。

3、预测突变体的结构

根据所选定的氨基酸残基位点及突变后的氨基酸种类，利用相关软件进行突变体的结构预测，将预测的结构与原始的蛋白质结构比较，利用蛋白质结构一功能或结构一稳定性相关知识及理论计算预测新蛋白质可能具有的性质，同时利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，以修正所选择的氨基酸位点和突变后的氨基酸种类。