应用噬菌体裂解法快速鉴定结核分支杆菌

结核病细菌学检查，是发现传染源的最主要途径和手段，是确定结核病诊断和化疗方案的重要依据，也是考 核疗效、评价防治效果的可靠标准。 因此，结核病细菌学检查是国家结核病控制规划(NTP)的重要组成部分，也是现代结核病控制技术策略之一。 然而，传统的结核分支杆菌分离培养方法需时较久，涂片阳性率又低，远不能满足临床诊治的需要。 因此，结核病细菌学快速检查历来是国内外学者所关注的热门课题。噬菌体裂解试验具有特异、快速、简便等优点，其在结核分支杆菌研究中的应用倍受关注。

1、敏感性试验

将结核分支杆菌H37Rr分别稀释成10～105cfr/ml进行检测，结果表明103cfu/ml MTB 即可用本法检出。

2、特异性试验

分别将结核、牛、非洲分支杆菌和10种常见NTM 及7种非分支杆菌进行试验 ，结果只有结核、牛、非洲分支杆菌为阳性，10种NTM和7种非分支杆菌均为阴性 。

3、临床分离株试验结果

将本市各区县结核病防治所分离培养的30株结核分支杆菌进行检测 ，结果均为阳性。

4、临床标本检测结果

60份临床确诊的肺结核患者痰标本，本法检测结果见图1。20份涂片和培养均为阳性的痰标本噬菌体裂解检测结果19份阳性；21份涂片阴性、培养阳性标本，本法阳性15份；另外19份涂片和培养均为阴性标本，本法阳性 5份。

图1

分支杆菌噬菌体在1947年首次分离，至今已分离出250余种。近20年来，分支杆菌噬菌体广泛用于DNA 重组技术中，并已在分支杆菌快速鉴定及药物敏感性试验中得以广泛应用。 我们应用荷兰AKZO NOBEL公司研制的Phage Tek MB试剂快速鉴定结核分支杆菌取得了满意结果。该方法的基本原理是分支杆菌噬菌体只能感染相应的活的分支杆菌，如待检标本中无相应的分支杆菌，则噬菌体被随后加入的杀毒剂全部杀死，故随后加入的指示细胞因未受噬菌体感染，因此能在培养皿中生长繁殖，无噬菌斑出现；如待检标本中含有相应的分支杆菌，则噬菌体侵入菌体内，免遭杀毒剂破坏，并在菌体内大量增殖，最终裂解菌体，释放出来的噬菌体即可感染指示细胞，并使指示细胞裂解出现噬菌斑。 因此，只要根据噬菌斑的有无，即可确定待检标本中是否含有相应的活的分支杆菌。 另外，由于所用指示细胞生长繁殖速度快，18—24 h 即可观察结果，因此本法具有快速诊断价值。

噬菌体裂解系统及其相关蛋白的研究进展

1896年，Hankin描述了一种可以限制霍乱流行、传播并有抗菌活性的物质一抗霍乱弧菌素，随后Gamaleya在枯草杆菌中发现了类似现象。噬菌体分别由Twort于1915年和Felix d’Herelle于1917年独立发现。噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的特异性病毒，即具有不同特性的、显示出长时期多种变异、适应和分化特征的超微生物。其中95%是双链DNA有尾噬菌体；其他少数噬菌体的颗粒大小、蛋白外壳和生活周期等差别很大。大多数噬菌体导致宿主细胞裂解，丝状噬菌体f1和M13等并不裂菌。噬菌体对其宿主的破坏作用很早就用于杀灭致病菌的研究。随着细菌耐药性的出现，对多种耐药性病原菌进行了很多探索性噬菌体治疗研究，现已有数百例关于噬菌体成功治疗人体感染的文献报道。噬菌体活体治疗存在很大的局限性，为寻找安全可靠的替代治疗方案，噬菌体裂解机制的研究越来越受到关注。按照是否需要溶菌酶，噬菌体裂解系统大致有两种基本模式：λ、T4等双链DNA大噬菌体的依赖噬菌体溶菌酶的裂解系统和单链DNA噬菌体φX174和单链RNA噬菌体MS2等小噬茵体的不依赖噬菌体溶菌酶的裂解系统。