原理

该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合，在电子显微镜下观察，由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。

根据标记方法的不同， 分为免疫铁蛋白技术、免疫酶标技术和免疫胶体金技术。如免疫铁蛋白技术是将含铁蛋白通过一种低分子量的双功能试剂与抗体结合，成为一种双分子复合物，它既保留抗体的免疫活性，又具有电镜下可见的高电子密度铁离子核心，因此用铁蛋白标记的抗体可通过电镜免疫化学的方法在电镜下定位细胞中的抗原。

影响免疫电镜的一些因素

1．标记物用于电镜观察的标记物有三类：一类是电子密度致密的标记物，如铁蛋白、辣根过氧化物酶等。另一类则是放射性同位素，如I、S、P、C、H等，第三类则是有独特形状的标记物，如血兰蛋白、噬菌体等。对标记物的要求是：具有特定的形状、不影响抗原抗体复合物的特性与形状。目前用于免疫电镜的标记物主要是铁蛋白和HRP。两者各有其优点，铁蛋白电子密度致密。观察时反差大，优于酶标记，但铁蛋白分子量大(460 000)，穿透能力差，所以适于细胞表面抗原的定位，另外铁蛋白的标记过程比较复杂。HRP分子量小(40 000)，穿透力强，有利于标记抗体进入细胞内，适于细胞内的抗原定位。

2．固定剂固定是免疫电镜较关键的一步，免疫电镜中的固定与一般超薄切片中的固定的不同之点在于既考虑保存细胞的超微结构,又要考虑到抗原的失活性问题。

（1）固定剂的要求：①不损害细胞内抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于渗透；④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。

（2）影响固定的因素有：①采用固定剂的种类；②固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差；③固定剂的pH；④固定剂的温度,一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细胞的自浴作用和水分的抽提；⑤固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致；⑥与被固定的细胞类型有关。目前常用的固定系统有：4%聚甲醛，1.5%～2%戊二醛，1%多聚甲醛+1%戊二醛，4%多聚甲醛+0.5%苦味酸+0.25%戊二醛，96%乙醇+1%醋酸。不论采用哪些系统，使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价，作为失活参考以再选择最适条件。

例如由于某些固定技术（如锇酸固定）对抗体抗原的结合有干扰，因此应采取较为温和的样品制备方法。

3．非特异性吸附 非特异性吸附与酶标抗体、抗血清的稀释度、染色时间，温度及介质等有关，其中最主要的是抗血清及标记抗体的稀释。一般认为高效价抗血清或标记抗体稀释到低蛋白浓度，用于标记染色可获得最理想的结果。因为低蛋白浓度有利于降低非特异性吸附。实际应用的蛋白浓度大致在0.50mg/ml～2mg/ml。工作效价一般在1︰20～1︰400,在实际工作中，将标记抗体或抗血清稀释到1︰100倍以上则可获得理想的阳性结果，而非特异性吸附必然降得很低。工作浓度的选择是将标记抗体或抗血清作1︰2、1︰4、1︰8……1︰256的稀释，做已知阳性标本的标记染色观察，取其阳性沉积物明显，而非特异性吸附最低的一稀释度做为工作浓度。4．标记染色法 标记染色法分为直接染色法与间接染色法两种。前者的特点是特异性较高,敏感性低，标记抗体只能用于检测一种抗原。后者敏感性较强，一种标记抗体可用于多种抗原的检测。缺点是特异性较差。

免疫电镜技术的操作程序

抗体的制备，标本的处理，免疫标记，对照实验、结果的观察和解析。

抗体的制备

特异性高、亲和力强的高效价抗体是获得理想的免疫标记结果的首要条件要。抗体可购买或自己制备。大分子完全抗原，可直接免疫动物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠来获得抗体。半抗原，用偶联剂使半抗原与大分子物质结合成复合物，再去免疫动物产生抗体，大分子物质称为载体蛋白，以甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为常用。偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等。目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为理想。

标本的处理

为了既能将抗原准确定位甚至定量，又能观察到近似于生活状态下的细胞超微结构，必须选择合适的固定剂，慎重处理样品。

取材

单细胞：培养细胞或血细胞应随用随取。悬浮培养细胞可先离心(800 rpm，5 min)，用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗1次后进行固定。贴壁细胞则可先将其培养在玻片上，用PBS轻轻冲洗后立即固定，也可用胰酶将细胞消化下来，按悬浮培养细胞的制备方法制备。