基本内容

维生素D3以海肝含量最为丰富，如每100克鳕鱼、比目鱼及剑鱼肝中分别含维生素D3200~750微克、500~10000微克、25000微克。其他如鲱鱼、鲑鱼、沙丁钽及鲳鲸等含有少量；禽畜肝脏、蛋类和奶类也是含有少量，每100克含量在100微克以下。在一般情况下，单靠从食物中获得足够的维生素D3是不容易的。

通过市场调查和实验结果，发现养殖户为了解决家禽缺乏维生素D3所带来的“弱腿病”、生长率和饲料利用率下降、产蛋率下降等问题，在饲料中添加维生素D3，为了更好的检测饲料中维生素D3含量1，科标生物检测中心现开发了其检测方法。

检测方法

实验原理

主要参照国标GB/T 17818-2010 饲料中维生素D3的测定 高效液相色谱法中第一法皂化提取法，试样经粉碎、过筛后，用碱溶液皂化，乙醚提取维生素D3，蒸发乙醚，残渣溶解于甲醇，取部分溶液用C18小柱净化，收集滤液，蒸发至干，用正己烷溶解，反相液相色谱柱分离测定，紫外检测器检测，外标法定量分析。

仪器和试剂

试验地点：青岛科标化工分析检测中心实验室。仪器：高效液相色谱仪带紫外检测器，AS3120超声波发生器；试剂：甲醇为色谱纯试剂，实验用水为超纯水，维生素D3标准品（购于日本CPE公司）。

试验方法

1. 皂化

称取样品（配合饲料称取10g~20g，浓缩饲料10g，维生素预混饲料或复合预混合饲料1g~5g）精确至0.0001g，置于250ml圆底烧瓶中，加入50ml 5g/LL-抗血酸乙醇溶液，混匀，加入10ml氢氧化钾溶液，混匀，置于沸水浴上回流30min，不时震荡防止样品粘附在壁上。皂化结束，分别用5ml无水乙醇、5ml蒸馏水自冷凝管顶端冲洗其内部，取出烧瓶冷却至室温。

2. 提取

定量转移全部皂化液于盛有100ml无水乙醚的500ml分液漏斗中，用40ml水分3次冲洗圆底烧瓶并入分液漏斗，用160ml乙醚分三次萃取，合并乙醚相。用100g/L氯化钠溶液洗涤一次，再用200ml水分2次洗涤乙醚萃取液至中性。用无水硫酸钠脱水乙醚提取液，转移到250ml棕色容量瓶中，加100mg2,6-二叔丁基对甲酚使之溶解，定容。以上操作在避光通风柜中完成。

3、浓缩

取部分提取液用氮气吹干，残渣用正己烷溶解，溶液用0.45µm过滤膜过滤，收集滤液，上高效液相色谱仪检测分析。

4、色谱条件

色谱柱：C18 色谱柱　150mm×4.6mm×5μm；

流动相：甲醇+水=95+5；

流速：1.0mL/min；