基本原理

1、择合适的靶序列：设计引物之前，必须分析待测靶序列的性质，选择高度保守、碱基分布均匀的区域进行引物设计。

2、长度：一般来说，寡核苷酸引物长度为15～30bp。

3、Tm值：引物的 Tm 值一般控制在55～60℃，尽可能保证上下游引物的Tm值一致，一般不超过2℃。若引物中的G+C含量相对偏低，则可以使引物长度稍长，而保证一定的退火温度。

4、（G+C）含量：有效引物中（G+C）的比例一般为40～60%。

5、碱基的随机分布：引物中四种碱基的分布最好是随机的，不存在聚嘌呤和聚嘧啶，尤其在引物的3’端不应超过3 个连续的G 或C。

引物设计原理参数设定

6、引物自身：引物自身不存在连续4个碱基以上的互补序列，如回文结构，发夹结构等，否则会影响到引物与模板之间的复性结合，尤其避免3’末端的互补1。

设计流程

先进行序列下载，然后进行同源性比较 ，最后进行引物设计筛选 。

基本原则

引物设计有3 条基本原则：

首先引物与模板的序列要紧密互补。

其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构。

再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) 。

具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素,如引物长度(primer length)，产物长度(productlength) ，序列Tm 值(melting temperature) ，引物与模板形成双链的内部稳定性(internal stability ，用ΔG值反映) ，形成引物二聚体(primer dimer) 及发夹结构(du2plex formation and hairpin) 的能值,在错配位点(falsepriming site) 的引发效率，引物及产物的GC 含量(composition)，等等。必要时还需对引物进行修饰,如增加限制性内切酶位点，引进突变等。

参考资料