测序原理

454测序原理

GS FLX系统的测序原理是基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，GS FLX系统将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。此技术不需要荧光标记的引物或核酸探针，也不需要进行电泳；具有分析结果快速、准确、高灵敏度和高自动化的特点。

测序流程

图1 454测序流程

1. 样品种类：GS FLX系统支持各种不同来源的样品序列测定，包括基因组DNA，PCR产物，BACs，cDNA及小分子RNA等，不同类型的样品测序都可在一台仪器上完成。

2. 样品DNA打断：样品如基因组DNA或BAC等被打断成300到800bp的片段；对于小分子的非编码RNA，这一步骤并不需要。短的PCR产物则可利用GS融合引物扩增后直接进行步骤4。

3. 加接头：借助一系列标准的分子生物学技术，将3′端和5′端有特异性的A和B接头连接到DNA片段上。接头也将在后继的纯化，扩增和测序步骤中用到。图1中仅仅显示了后续步骤中要用到的单链的DNA片段。

4. 一条DNA片段=一个磁珠：接头使成百上千条DNA片段分别结合到一个磁珠上，磁珠被单个油水混合小滴包被后，在这个小滴里进行独立的扩增，而没有其他的竞争性或者污染性序列的影响，从而实现了所有DNA片段进行平行扩增（emPCR）。

5. 一个磁珠=一条读长：经过emPCR扩增后，每个磁珠上的DNA片段拥有了成千上万个相同的拷贝。经过富集以后，这些片段仍然和磁珠结合在一起，随后就可以放入到Pico Titer Plate板中供后继测序使用了。

6. 数据读取和分析工具：GS FLX

系统提供三种不同的生物信息学工具对测序数据进行分析，适用于不同的应用。例如多达3Gb序列的重测序，对比已知参考序列进行的扩增产物差异分析及120Mb的从头测序工作等。

罗氏454测序系统是最早出现的新一代测序系统，其应用成果在Nature，Science上发表了多篇论文。454系统自推出以来进行了多次升级，最新的GS FLX序列分析仪的配合Titanium系列测序试剂具有更高的测序通量（400Mb每反应），具有更加广泛的灵活性和准确性，并且保持了新一代测序技术中运行速度最快（3-5天）和最高单序列读长（400bp）的优势，而且单一读长的准确性可以超过99.5%，完整测序结果一致准确性大于99.99%。Titanium系列中的新成员，长距离Paired-End试剂盒更能对长达3-20kb的插入片段进行双端测序，突破了新一代测序技术对重复序列较差的瓶颈。此外，具备完整的软件包是GS FLX的一大特色，其简单易用的图形界面，可以用来进行作图、拼接和扩增产物差异检测等研究。同时GS FLX因为其超高的测序读长，可以和传统的序列分析软件相互接轨，也是其他新一代测序技术所不能实现的。正因为其优异的性能，GS FLX 系统可以广泛应用在全基因组de novo测序和BAC文库重测序、扩增产物重测序、转录组分析、基因调节的研究等基因组学研究中1。

TBC服务内容

（一）全基因组de novo测序

（二）转录组测序

（三）全基因组或基因组区域重测序

（四）扩增产物重测序

（五）宏基因组测序