实时荧光定量PCR

定量分析方法

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。·

Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据1。

基本信息

荧光定量PCR

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR技术类型概述

	DNA结合染料法	基于探针的化学法	猝灭染料引物法
举例	SYBR Green I	TaqMan、分子信标、Scorpion和杂交探针	Amplifluor和LUX荧光引物
基本原理	应用一种带有荧光的、非特异的DNA结合染料检测PCR过程中积累的扩增产物。	应用一个或多个荧光标记的寡核苷酸探针检测PCR扩增产物；依赖荧光能量共振传递（FRET）检测特异性扩增产物。	采用荧光标记引物扩增，从而使荧光标记基团直接掺入PCR扩增产物中；依赖荧光能量共振传递（FRET）。
特异性	检测所有双链DNA扩增产物，包括非特异反应产物，如引物二聚体。	仅检测特异性扩增产物。	检测特异性扩增产物及非特异反应产物，如引物二聚体。
应用	DNA及RNA定量；基因表达验证	DNA及RNA定量；基因表达验证；等位基因鉴别；SNP分型；病原体和病毒检测；多重PCR
优点	可对任何双链DNA进行定量；不需要探针，因此减少了实验设计及运转成本；适合于大量基因的分析；简单易用。	探针和目标片段的特异性结合产生荧光信号，因此减少了背景荧光和假阳性；探针可标记不同波长的荧光基团，用于多重PCR反应。

检测方法

1.SYBRGreenⅠ法：

在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。

SYBR定量PCR扩增荧光曲线图

PCR产物熔解曲线图（单一峰图表明PCR扩增产物的单一性）

2.TaqMan探针法：

探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的形成完全同步。

服务流程

1.客户认真写好订单，提供待检基因相关信息；

2.签订技术服务合同，支付预付款（30-50%)；

3.设计合成定量PCR引物（或客户提供文献引物委托本公司合成）；

4.DNA/RNA的抽提、定量、RNA反转录；

5.PCR预实验，主要检测引物的特异性和扩增效率；

6.正式定量实验：对所有样品上机检测；