DNA技术
概念
DNA(Deoxyribonucleic acid)，中文译名为脱氧核糖核酸，是染色体的主要化学成分，同时也是基因组成的，有时被称为“遗传微粒”。DNA是一种分子，可组成遗传指令，以引导生物发育与生命机能运作。主要功能是长期性的资讯储存，可比喻为“蓝图”或“食谱”。其中包含的指令，是建构细胞内其他的化合物，如蛋白质与RNA所需。带有遗传讯息的DNA片段称为基因，其他的DNA序列，有些直接以自身构造发挥作用，有些则参与调控遗传讯息的表现。
发展历程
我国法医DNA技术的发展道路不是很长，但却取得了突出的成果，在侦查破案中发挥了巨大的作用。 在“七五”后期，从1987年起，我国正式立项对DNA指纹技术进行研究，经过两年的努力，至1989年我国首次把DNA指纹技术应用于办案，开始了我国 法医DNA检验的新时代。随着DNA指纹技术的不断应用，技术人员越来越感到其不能满足实际工作的需要，存在许多不足之处。 “八五”期间，我国把解决法医DNA检验存在的疑难问题的研究列入重点攻关计划。在DNA指纹技术的研究中装备了国产化的多位点探针，建立了用非同位素标 记探针的方法检测DNA指纹技术;在利用PCR技术进行DNA检验的研究中建立了检测DNA扩增片段长度多态性的方法，用于一系列多态性位点的分析;在解 决毛发、指甲等特殊检材的检验上，建立了测定人类线粒体DNA序列多态性的方法。所有这些成果，扩大了DNA技术检验各种检材的能力，更加适合于实际检材 的需要，尤其是PCR检验方法的建立，使得DNA技术更有生命力，适合于推广应用。 进入“九五”期间，我国法医DNA检验技术又有了新的发展，除了对一些疑难检材如骨骼等的检验进行研究外，商品化DNA检验试剂盒的出现，使DNA检验技 术更加规范和标准化，尤其是STR复合扩增技术的应用使DNA检验技术步入了新的阶段。在检测方法上，也从银染法人工染色、肉眼观察分析结果发展到荧光法 自动电泳收集、计算机分析结果，一次检验分析的STR多态性位点显著增多，最多的一次检验可达16个位点，大大提高了个体识别率，达到了同一认定的水平。 经过十余年的刻苦攻关，法医DNA检验技术取得了丰硕的成果，DNA指纹技术正日趋被淘汰。目前，随着PCR多态性系统的大量增多，基于PCR方法进行的检验在个体识别率上显著提高，在我国使用DNA指纹进行办案的实验室也大大减少，该方法在案件鉴定中已基本被淘汰。 STR是存在于人类基因组DNA中的一类具有长度多态性的DNA序列，其核心序列一般由2～6个碱基构成，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长 度多态性。一般认为，人类基因组DNA中平均每6～10kb就有一个STR位点，其多态性成为法医物证检验个人识别和亲子鉴定的丰富来源。与DNA指纹技 术相比，基于PCR技术的STR多态性分型在操作上要简便得多，在灵敏度上要高得多，在检验降解DNA的能力上要强得多，在结果分析上要标准得多。同时， 由于STR的扩增片段较短、扩增条件类似，能够在同一体系中进行复合扩增，一次检验就获得较多的多态性信息。分析STR位点的多态性是法医DNA检验技术 的新突破，目前己成为法医学上个体识别和亲子鉴定主要技术方法。 在检测方法上，目前国内根据各自实验室情况的不同，分别采用银染法和荧光法进行STR的分型。近两年来，荧光法检测技术以其快速(一次检验仅需数小时)、 灵敏度高(适合现场提取的微量样品的检验)、检验结果更加准确(每个泳道内都加入内标)、易于标准化和建立数据库等优点逐渐代替了银染法检测技术，但是使 用荧光自动分析方法对STR位点分型又有所需仪器设备以及所用消耗试剂昂贵的缺陷。 |
DNA的复制、修复与重组DNA技术
DNA是储存遗传信息的物质，亲代的遗传信息如何真实地传给子代，这个问题的实质就是DNA分子如何复制(replication)成完全相同的两个拷贝，即DNA的合成，可见通过复制，遗传信息得以在传代中保留。
DNA分子中的遗传信息又如何表达呢？现知基因表达的第一步是通过转录(transcription)，即DNA的碱基按互补配对（G-C，A-T，A-U）的原则转变为RNA分子上相应的碱基序列，接着RNA通过翻译（translation），以三个碱基的序列作为一个氨基酸的遗传密码，从而决定蛋白质的一级结构。不同基因编码不同结构的蛋白质，表现出不同的功能，因而体现出多种多样的生命现象。遗传信息从DNA经RNA流向蛋白质的过程，是Crick于1958年提出的，称为分子生物学的中心法则(central dogma)(图12-1)。1970年Temin提出“逆向转录”(reverse transcription)扩充了中心法则的范围。
基因或DNA是遗传信息的携带者，在细胞分裂过程中，亲代细胞所含的遗传信息，完整地传递到两个子代细胞。这个过程的实质问题是DNA分子如何复制成完全相同的两个拷贝，有许多酶和蛋白质参与复制过程，通过正确和完整的复制，亲代DNA的遗传信息真实地传给子代，这是遗传信息一代一代传递下去的分子基础，这也是本章的重点内容。但生物体内外环境存在着使DNA分子损伤的因素，因此机体还必须有一套DNA修复的机制。最后还将介绍一些有关重组DNA技术的概念和方法。
DNA复制的几个基本原则
一、半保留复制
Watson和Crick于1953年提出的DNA双螺旋模型，碱基互补配对的原则，为DNA分子的复制提供了理论基础，即亲代的DNA双链，每股链都可以作为模板，按碱基互补配对原则指导DNA新链的合成，这样合成的两个子代DNA分子，碱基序列与亲代分子完全一样。但一条链是来自亲代的DNA链，另一条链是新合成的链，此即为半保留复制 (semiconservative replication)。用15N标记亲代的DNA链，而用14N标记新合成的DNA链的实验，证实子代的DNA分子，一股链含15N，另一股含14N。
二、半不连续复制
DNA双螺旋的两股链是反向平行(antiparallel)的，新合成的两股子链，一股的方向为5′→3′，另一股为3′→5′。那么体内是否存在两种DNA聚合酶?一种催化核苷酸以5′→3′方向聚合，另一种以3′→5′方向聚合。但从现知所有的DNA聚合酶都只能催化5′→3′方向合成。这个问题直到1968年冈崎(Okazaki)发现大肠杆菌DNA复制过程中出现一些含1000 ~2000个核苷酸的片段，一旦合成终止，这些片段即连成一条长链。这种小片段被称为冈崎片段(Okazaki fragment)。因此，复制时亲代DNA分子中那股3′→5′方向的母链作为模板，指导新链以5′→3′方向连续合成，此链称为前导链(1eading strand)。在前导链延长1000 ~2000个核苷酸后，另一母链也作为模板指导新链也是沿5′→3′合成1 000 ~2 000个核苷酸的小片段，这就是冈崎片段。随着链的延长，可以有许多个冈崎片段，这条称
为随从链(1agging strand)。可见，随从链为不连续复制，所以DNA为半不连续复制(semi-discontinuous replication)，如图12-2所示。复制后，这些冈崎片段由DNA连接酶的作用而连接成完整的新链。
三、RNA引物
目前所发现的DNA聚合酶都需要一个具3′-OH的引物，才能将合成原料dNTP一个一个接上去。因为DNA聚合酶不能催化两个游离的dNTP在DNA模板上进行聚合，如图12-3所示。实验又发现抑制RNA聚合酶的药物如利福霉素(rifampicin)能抑制DNA的复制。再者在体外DNA复制实验中发现冈崎片段的5′端都有一小段4~12个核苷酸的RNA引物(RNA primer)。现知RNA聚合酶合成新链时不需要引物，能直接催化游离NTP聚合。可见RNA引物为DNA聚合酶提供聚合新核苷酸所需的3′-OH。RNA引物最后被DNA聚合酶Ⅰ除去，留下的空隙也由该酶补满，缺口再由DNA连接酶封口。
在DNA的复制需要RNA引物呢，除了DNA聚合酶不能催化两个游离dNTP的聚合，而RNA引物酶却具有此能力外，这种作用尚可尽量减少DNA复制起始处的突变。因为游离核苷酸起始处的聚合最容易出现差错，若用RNA引物，即使出现差错，由于最后将被DNA聚合酶Ⅰ切除，便可提高DNA复制的真实性。
四、复制的真实性
DNA复制过程是非常复杂的，需要许多酶类和蛋白质因子参加。这既保证DNA复制的速度，又保证产物的高度真实性。这也保证了自然界种族延续中生物遗传特性的相对稳定性。