简介

层粘连蛋白对体外角膜上皮细胞凋亡的保护

经验交流

观察层粘连蛋白（LN）对离体角膜上皮细胞存亡的影响，以寻找预防角膜上皮细胞凋亡的途径。方法应用流式细胞仪(FACStarplus)检测凋亡细胞的亚2倍体DNA的方法，对基础培养的、与LN共育的以及阻断LN受体后的兔角膜上皮细胞的凋亡情况进行了对比观察及分析。结果基础培养的第6代角膜上皮细胞出现明显的细胞凋亡；与LN共育的角膜上皮细胞凋亡不明显；阻断LN受体后，角膜上皮细胞出现显著的凋亡现象，结论LN对离体培养的角膜上皮细胞的凋亡有保护作用。

利用培养的角膜上皮行角膜移植以改善眼表，是治疗角膜表面疾患的新尝试。体外能获得长期存活并增殖的角膜上皮细胞是此方法实施的前提，可是在我们对角膜缘上皮细胞进行离体培养时，历经几次细胞传代培养，上皮细胞的增殖力逐渐减弱，最后停止增殖而死亡。为探索细胞死亡的原因，我们应用基础培养、与层粘连蛋白(laminin，LN)共育以及阻断LN受体法，对离体角膜缘上皮细胞的存活情况进行了观察及对比分析，以寻找预防细胞凋亡的途径。

具体过程

1　材料与方法

1．1　角膜上皮细胞培养法

1．1．1　基础培养法　取新鲜兔眼球，无菌处理后，取浅层带有角膜上皮的角膜缘组织，以质量浓度0.25%胰蛋白酶－0.01mol/L　EDTA孵育消化法获取角膜上皮细胞(1×106/ml)，在含有10%小牛血清的F12－DMEM（Gibco，USA)培养液中，5%CO2，37℃，饱和湿度培养箱中培养。48h传代1次。

1．1．2　与LN共育法　将96孔培养板底涂一层LN液(25μg/cm2)，－70℃冻干后，将角膜上皮细胞(1×106/ml)种于上。5%CO2，37℃，饱和湿度培养箱中培养48h

1．1．3　阻断LN受体法　将角膜上皮细胞种植在含有10μg/ml抗－LN单克隆抗(Sigma，USA）培养液中，5%CO2，37℃，培养48h。

1．2　细胞凋亡的流式细胞仪检测法

用质量浓度0.25%胰蛋白酶、0.01mol/L　EDTA消化培养48h后的各组角膜上皮细胞，收集细胞，调细胞浓度在1×106个/ml；取1ml细胞悬液，离心800～1000r/min，10min，弃上清；重悬细胞于100μl的PBS中；慢慢滴注细胞悬液到(事先预冷－20℃)5ml的70%的乙醇中固定；放置4℃中待用。用前离心去除固定液；加PNAase　200μl37℃水浴30min；再加入800μl碘化丙啶(prooidium　iodide，PI)染色液，混匀，4℃，避光30min；在FACStarplus流式细胞仪上分析细胞凋亡(亚2倍体DNA)的情况。实验获取的数据经SPSS　4.0统计学软件处理分析。

2　结果与分析

2．1　离体角膜上皮细胞在基础条件培养下的细胞凋亡检测结果　角膜原代上皮细胞被检测出7.00%±2.23%的凋亡细胞。第1代到第5代各组细胞与原代相比，细胞凋亡率并无明显变化(P>0.01)；从第6代开始，角膜上皮细胞凋亡率为18.74%±3.93%，与原代相比，细胞凋亡率有显著升高(P<0.01)。

2．2　与LN共育的第6代角膜上皮细胞凋亡率明显低于基础条件培养下的同代细胞(P<0.01)，见表1。

表1　LN对离体培养的角膜上皮细胞

表1　LN对离体培养的角膜上皮细胞